استفاده از پروتئين هاي نوتركيب به هم پيوسته در ابداع يك سيستم نو به منظور شناسايي پروتئازهاي سيتوپلاسمي جديد

چکیده

زمينه و اهداف: با توجه به اهميت و نقشي كه اندوپروتئازها در فيزيولوژي سلولي و ايجاد بيماري ها دارند و با عنايت به اينكه تاكنون تعداد معدودي از پروتئازهاي جايگاه گزين شناخته شده اند، ابداع روش بيولوژيك تكرار پذير و قابل اعتمادي كه شناسايي اندوپروتئازهاي جايگاه گزين را ميسر سازد، از اهميت بسزايي برخوردار خواهد بود. بر اين اساس در تحقيق حاضر با به كارگيري پروتئين هاي نوتركيب به هم پيوسته سيستم بيولوژيك جديدي جهت شناسايي پروتئازهاي سيتوپلاسمي جايگاه گزين ابداع گرديد. براي ابداع سيستم مورد نظر از تركيب عملكرد دو پروتئين نوتركيب 16-VP4GAL و HSV.tk-Zeo استفاده شد. روش بررسي: براي ساختن وكتورها از روش هاي بيولوژي مولكولي استفاده شد. وكتورهاي ساخته شده توسط باكتري هاي پذيرا تكثير داده شدند و جهت بررسي كارآيي آنها از سلول هاي HeLa استفاده شد. بدين منظور سلول هاي حيواني با وكتورهاي ساخته شده ترانسفكت و تكثير داده شدند. سپس با استفاده از آزمايش MTT حساسيت سلول ها به داروها مطالعه شد. يافته ها: سلول هاي HeLa با وكتور pcDBHZm كه حاوي كاست القا‌پذير HSV.tk-Zeo بود، ترانسفكت شده و با داروي 418G انتخاب و تكثير داده شدند. سپس سلول هاي ترانسفكت شده با پلاسميد pcDBHZm مجدداً با پلاسميد ديگري به نام 16VP4pcG، كه طي اين مطالعه ساخته شده بود، ترانسفكت شدند. در اين مرحله، حساسيت دو نوع سلول ترانسفكت شده نسبت به داروي GCV، در مقايسه با سلول هاي ترانسفكت نشده (كنترل منفي) و سلول هاي ترانسفكت شده با پلاسميد pCCI (كنترل مثبت) ارزيابي شد. نتايج به دست آمده نشان داد كه سلول هاي ترانسفكت شده با pcDBHZm حدود 30 برابر مقاوم تر از سلول هاي 16pcDBHZm+pG4VP به GCV بودند. متعاقب اثبات اين امر، پلاسميد pcG4mVP ساخته شد. در اين پلاسميد محل برش چند آنزيم محدودگر ما بين قطعه نوكلئوتيدي 4GAL و 16VP ايجاد شد تا امكان قرار دادن كتابخانه نوكلئوتيدي يا توالي هاي مشخص را فراهم آورد كه به ترتيب براي شناسايي پروتئازهاي جديد و بررسي وجود پروتئازهاي شناخته شده در سلول هاي مختلف مورد استفاده قرار مي گيرد. نتيجه گيري: نتايج به دست آمده مؤيد كاركرد سيستم ابداع شده بود. بدين صورت كه در سيستم ابداع شده، بيان كاست HSV.tk-Zeo تحت كنترل پروتئين مركب 16-VP4GAL بوده و در حضور اين پروتئين، cDNA هاي مزبور بيان مي شوند. بيان كاست مزبور حساسيت سلول ها به GCV را در مقايسه با موقعي كه 16-VP4GAL در سلول ها غير فعال است، حدود 30 برابر افزايش مي دهد و باعث كشته شدن سلول هاي محتوي 16-VP4GAL فعال در حضور GCV مي شود (انتخاب منفي). اين امر امكان جدا سازي سلول هاي محتوي 16-VP4GAL غير فعال (متعاقب هضم آنزيمي پروتئين مزبور) از سلول هاي محتوي 16-VP4GAL فعال (به دليل عدم هضم آنزيمي پروتئين مزبور) را در حضور GCV ميسر مي سازد.