چکیده
زمينه و اهداف: آلفافيتوپروتئين بطور طبيعي در سرم جنيني يافت مي شود، در حاليكه توليد و ظاهر شدن آن بعد از تولد حاكي از وجود تومورهاي سرطاني است. بنابراين با تعيين مقدار اين پروتئين، در دوره هاي جنيني و بعد از تولد مي توان عارضه هاي مختلف جنيني، توموري و غيرتوموري را تشخيص داد. از اينرو توليد و خالص سازي اين پروتئين به روش فن آوري DNA نوتركيب به منظور توليد كيت تشخيصي حائز اهميت بسيار مي باشد.
روش بررسي: پيكيا پاستوريس مخمر متيلوتروفي است كه براي توليد آلفافيتوپروتئين انساني مورد استفاده قرار گرفت. براي تكثير قطعه ژن مورد نظراز حامل كلونينگ pUC18 و براي بيان پروتئين از حامل دوميزبانه pHIL-S1 استفاده گرديد. بعد ازايجاد پلاسميد نوتركيبpS1-AFP از روشهاي الكتروپوريشن و روش شيميايي ليتيوم كلرايد براي انتقال به سلولهاي مستعد سويه GS115- HIS - استفاده گرديد. براي غربالگري نيز از محيط اگزوتروفيك فاقد هيستيدين استفاده گرديد. به منظور بررسي نحوه اتصال ژن مورد نظر به ژنوم مخمري و فنوتيپ هاي حاصله، از روشPCR استفاده شد. در راستاي بيان ژني از محيط هاي كشتYPG و YPM استفاده گرديد و ميزان كمي و كيفي توليد پروتئين مورد نظر نيز با استفاده از ژل SDS-PAGE و روش ELISA مورد بررسي قرار گرفت.
يافته ها: برش آنزيمي پلاسميد نوتركيب pS1-AFP ترانسفورم شده حاكي از دريافت قطعه Kbp 78/1 ژن AFP بود كه در ژل آگاروز(1% ) بدست آمد. PCR به عمل آمده نيز وجود اين قطعه را تائيد كرد. انتخاب سويه هاي ترانسفورم شده mutS در مقايسه با mut + و كشت آنها در محيط گليسرول ( YPG ) تا حصول كدورت OD600= 6 و سپس انتقال به محيط كشت متانول ( YPM) با افزودن متانول تا 1% غلظت نهايي سبب حفظ القاء توليد پروتئين در محيط اگزوتروفيك فاقد هيستيدين گرديد. ميزان توليد اين پروتئين حدود ug/ml 10 بدست آمد.
نتيجه گيري: اين مطالعه نشان داد كه قرار دادن ژن سيگنال ترشحي اسيد فسفاتاز و راه اندازAOX1 در ابتداي ژن AFP براي بيان و ترشح اين پروتئين مناسب
مي باشد. بنابراين مي توان در راستاي توليد آنتي بادي تك دودماني (منو كلونال) از آن استفاده كرده و با خالص سازي آن كيت هاي تشخيصي آزمايشگاهي را طراحي كرد.