چکیده
زمینه. جهش PIK3CA: H1047R یکی از شایعترین جهشهای پیشبرنده در سرطان پستان است که فعالسازی غیرکنترل شده مسیر پیامرسانی PI3K/AKT/mTOR را به دنبال دارد. شناسایی سریع و کم هزینه این جهش میتواند نقش کلیدی در انتخاب برنامه درمانی هدفمند و بهبود پیشآگهی بیماران ایفا کند. هدف این مطالعه، توسعه و بهینهسازی یک روش اختصاصی برای شناسایی این جهش بدون نیاز به تجهیزات پیشرفته آزمایشگاهی بود.
روش کار. پرایمرهای اختصاصی FIP و BIP بهگونهای طراحی شدند که انتهای 5′ آنها مکمل نوکلئوتید جهشیافته باشد. همچنین، یک پرایمر حلقه برای افزایش کارایی و سرعت واکنش طراحی شد. واکنش LAMP روی DNA ردههای سلولی MDA-MB-453 (جهشیافته) MCF-7 (نوع وحشی) انجام شد و حساسیت روش با رقیقسازی سریالی ارزیابی گردید. برای مشاهده نتایج، از روش رنگسنجی با رنگ قرمز خنثی و همچنین فلورسانس با سایبر گرین استفاده شد. علاوه بر این، به منظور تأیید اهمیت این جهش دادههای توالییابی RNA مربوط به بیماران دارای جهش از پایگاه داده TCGA استخراج و بیان ژنهای مسیر پیامرسانی PI3K بررسی شد.
یافتهها. روش طراحی شده توانست توالی جهش یافته را با اختصاصیت مناسبی از نوع وحشی تفکیک کند. افزودن پرایمر حلقه موجب کاهش زمان واکنش و افزایش حساسیت شد؛ به طوری که حد تشخیص روش 0/033 نانوگرم میکرولیتر تعیین گردید. رنگ قرمز خنثی قادر بود تغییر رنگ واضح بین نمونههای مثبت و منفی ایجاد کند؛ در حالیکه سیگنال سایبر گرین تفاوت چشمگیری نداشت. تحلیل توالییابی RNA نیز نشان داد جهش H1047R باعث بازآرایی الگوی بیان ژنهای مسیر PI3K/AKT/mTOR شده و چندین ژن کلیدی این مسیر دچار افزایش یا کاهش بیان معنادار میشوند.
نتیجهگیری. روش PE-LAMP توسعه یافته در این مطالعه، روشی سریع، حساس، کمهزینه و قابل مشاهده با چشم غیرمسلح برای تشخیص جهش PIK3CA: H1047R است و میتواند به عنوان یک ابزار مناسب برای غربالگری و تشخیص مولکولی در مراکز با امکانات محدود مورد استفاده قرار گیرد. این روش با توجه به عملکرد مناسب و نیاز اندک به تجهیزات، پتانسیل تبدیلشدن به یک ابزار بالینی برای انتخاب درمان هدفمند در بیماران سرطان پستان را داراست.
پیامدهای عملی. به کارگیری روش توسعه یافته در این مطالعه میتواند تشخیص جهش PIK3CA: H1047R و در آینده جهشهای دیگر را در مراکز درمانی و آزمایشگاهی با امکانات محدود تسهیل کند. سرعت بالا، هزینه کم و قابلیت مشاهده نتایج با چشم غیرمسلح، این روش را برای غربالگری اولیه بیماران و انتخاب سریعتر درمانهای هدفمند مناسب میسازد. علاوه بر این، امکان استفاده از آن در محیطهای نزدیک به بیمار (Point of care) میتواند به بهبود دسترسی بیماران به روشهای تشخیص دقیق مولکولی کمک کند.